细胞株筛选克隆的方法有哪些呢？
点击次数：2319 更新时间：2019-11-23
生产用稳定细胞株的构建首先由表达载体的构建和细胞转染开始
1、将表达抗体的目的基因构建到载体上，再将该载体转染进入宿主细胞内，常见的转染方式主要有钙转、电转、脂质体转染和逆转录病毒转染，DNA进入宿主细胞核后将会随机整合到宿主细胞基因组当中去，因此表达水平与基因拷贝数、基因整合位点的转录活性有关。
2、接下来不同筛选试剂将被用于筛选能够正确表达目的基因并且高水平表达的细胞群(pool）。
3、由于此时得到的细胞群中的每个细胞特性各异，具有不同的基因整合位点、拷贝数、细胞单产和生长速率，因此需要将其中具有高产、稳定表达特性的细胞个体分离出来分别培养，通常需要获得数百甚至上千的候选克隆供进一步筛选。
4、被筛选出来的克隆经过传代培养和分批补料实验(Fed-batch)，比较其生长特性、代谢状况、表达量高低、表达产物质量等，选出的几个克隆进入生物反应器放大实验，同步评估细胞株稳定性，终确定生产用单克隆细胞株。
常用的细胞株筛选克隆的方法
1、有限稀释法（Limiting dilution cloning，LDC）因为其低成本和易于操作，被广泛运用于克隆的筛选。需要注意的是，为符合FDA的申报要求需进行两轮LDC，且细胞密度<0.5细胞每孔或者一轮LDC结合图像证明，以验证单克隆性。有限稀释法工作量大，往往需要运用自动化工作站进行高通量的筛选。
2、半固体培养基法进行单克隆的筛选。细胞生长在半固体培养中，形成单克隆细胞团，同时将抗体分泌在细胞团周围，半固体培养基中含有荧光标记的二抗，能与抗体Fc片段特异性结合，当用一定波长的光进行激发时就能发出荧光。使用图像分析软件能够对单克隆细胞团的大小、荧光强度进行测定，从而筛选出生长旺盛、表达量高的单克隆细胞团。自动化的机械臂能够按照实验人员设定的参数将符合要求的细胞团挑取出来用于后续的扩大培养。半固体培养基法能够通过自动化的方式挑取单克隆细胞，大大减轻了实验人员的工作负担，但用于荧光扫描、图像分析和克隆挑取的机器价格昂贵，且为符合申报要求，需要两轮半固体培养基筛选或一轮半固体培养基筛选结合一轮LDC进行。
3、流式细胞仪分选法（FACS）。将带有荧光标记的二抗和分泌抗体的CHO细胞混合孵育，分泌到细胞表面的抗体就能够被流式细胞仪检测到，从而利用其分选功能筛选出分泌多的细胞。为了使分泌到胞外的抗体能够维持在细胞膜表面，还可以使用微囊将细胞以及分泌的抗体包裹起来。
克隆筛选工作往是微量、高通量，检测和操作手段的改善和升级非常重要，如HTRF（均相时间分辨荧光），可以使用较小的样品量（2.5-5.0μL）进行高通量（384孔板）检测，结合自动化工作站的辅助，能够大幅降低研发人员的工作量。
